自诞生之初，crispr基因编辑技术一直无法克服的难题就脱靶效应。脱靶效应有可能导致基因突变，其不确定性和未知的安全风险限制了基因编辑技术的推广应用。目前的基因编辑技术尚无法精准靶向目标序列，并不产生脱靶效应。科学家认为，既然无法完全避免，为安全起见，更好地了解、控制可能产生的脱靶效应是一个不错的选择。因此，脱靶检测方法的开发成为了基因编辑领域的一个研究热点。
近日，国际顶级学术期刊《科学》报道了一种新型基因编辑脱靶检测方法，名为discover-seq （discovery of in situ cas off-targets and verification by sequencing）。该方法可利用细胞和生物中dna修复因子的募集特征，准确鉴定体内基因编辑细胞的脱靶位点和cas活性的分子表征。该研究由加利福尼亚大学伯克利分校创新基因组研究所(igi)、格拉德斯通研究所(gladstone institute)和阿斯利康(astrazeneca)的研究团队共同完成，文章题为“unbiased detection of crispr off-targets in vivo using discover-seq”。
虽然已经有不同的方法检测crispr脱靶效应，但这些方法在实际应用中存在各种限制。例如，目前的脱靶检测方法多使用纯化的dna或特定的细胞模型，无法实现体内直接检测，并且存在产生假阳性结果以及杀死被检测的细胞等问题。此外，最常用的检测方法仍仅限于实验室培养的细胞，不适用于患者来源的干细胞或者动物组织。
新开发的discover-seq方法，可通过精确追踪体内dna修复因子的募集，以单碱基分辨率揭示细胞中cas活性的分子特性。经研究验证，discover-seq适用于多种grna格式和cas酶类型，并可用于表征新的编辑工具。此外，经研究验证，该方法可在患者诱导多能干细胞和小鼠细胞等任何生物系统的基因编辑过程中实时检测脱靶效应，而不仅限于实验室培养的细胞，为基因编辑治疗期间患者体内脱靶检测铺平了道路。
图1. discover-seq工作流程
文章第一作者、igi博士后研究员beeke wienert表示：“在crispr切割时会破坏dna。为了生存，细胞会将许多不同的dna修复因子募集到基因组中的特定位点，修复断裂并将切割末端连接在一起。如果我们能够找到这些dna修复因子的位置，也就可以识别被crispr切割的位点。”
由于dna修复蛋白可以利用chip-seq鉴定化脓性链球菌cas9靶点，所以该研究对不同的dna修复蛋白进行了分析，并重点研究了mrn复合物的mre11亚基。mre11是第一个被募集到切割位点的修复蛋白，会紧密分布在cas9切割位点周围。研究发现，在基因插入和缺失出现之前，mre11与损伤dna的结合就会达到高峰，并且在已知grna脱靶时很容易被检测到。
研究人员表示：“人类基因组非常庞大，如果打印完整的dna序列，会得到一本16层楼高的小说。当我们用crispr切割dna时，就像删除该小说中特定页面上的某个特定单词一样。dna修复因子就像在书中添加不同类型的书签，有的标签是针对整个章节，但mre11可以确切到某一个字母。”
图2. discover-seq可在患者衍生的诱导多能干细胞和小鼠体内进行实时的脱靶检测。
在基因组检测中，discover-seq可以利用mre11鉴定crispr切割的确切位点，检测结果更可靠。大多数mre11 chip-seq的检测结果与预测的cas9切割位点一致，进而能够以单碱基分辨率鉴定核酸酶位点，揭示cas活性的分子特征。需要注意的是，discover-seq检测方法依赖于细胞的自然修复过程，侵入性更小，且适用于多种grna形式和cas酶类型。
通过应用于新的细胞类型和系统，discover-seq还能揭示crispr基因组编辑机制的新见解，有助于人们更好地理解crispr的工作原理。discover-seq大大简化了脱靶的检测过程，同时提高了检测结果的准确性。同时，该方法有助于我们更好地预测基因组编辑在临床环境中的运作方式，改善临床前研究，使基于crispr的疗法更能满足有需求的患者。
在基因编辑脱靶检测方面，我国科学家也在不断努力。今年3月，中国科学院等单位的研究人员成功开发了一种新型脱靶检测技术goti，该技术可在不借助于任何脱靶位点预测技术的情况下发现随机脱靶位点，显著提高了基因编辑脱靶检测的敏感性。
在治愈人类罕见病、遗传病方面，基因编辑技术被寄予厚望，但在过去的几十年中，科学家始终难以克服脱靶效应这个难题，这也成为制约该技术成功应用于临床的一大瓶颈。在更安全有效的基因编辑工具出现之前，精准的脱靶检测技术或将成为基因编辑技术临床转化的关键。
参考资料：
1. unbiased detection of crispr off-targets in vivo using discover-seq
https://science.sciencemag.org/content/364/6437/286.full?_ga=2.217470229.2076339049.1556000128-1911026261.1556000128
2. discover-seq detects off-target crispr effects
https://www.genengnews.com/news/discover-seq-detects-off-target-crispr-effects/
